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GENERALIDADES
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La Unidad de Genómica y proteómica de los
SSTTI viene funcionando desde el año 1998 y presta servidio en
el área de investigación básica en Biología
y Bioquímica Molecular. La sección de Proteómica
de la unidad está integrada en el Nodo 5 en ProteoRed, el
Instituto Nacional de Proteómica, una de las plataformas
técnológicas promovidas por la Fundación Genoma
España para favorecer el desarrollo de la investigación
biomédica y biotecnológica.
Secuenciación automática de DNA
La
Secuenciación automática de DNA desarrollada por Applied
Biosystems utiliza la metodología de Sanger con una polimerasa
termoestable que permite una reacción de secuenciación
cíclica. El producto de la reacción se separa mediante
electroforesis capilar y detección de fluorescencia inducida por
láser.
La
detección de cada una de las bases se realiza por el
método de terminación de cadena en el que los
ddNTPs se encuentran marcados con 4 fluorocromos distintos, de tal
forma que a medida que se incorporan y detienen la elongación,
marcan la base que han incorporado. Estos fluorocromos están
incorporados en el kit Big Dye que se utiliza en el servicio y que
incluye la polimerasa, el MgCl2,
los dNTPs, ddNTPs marcados y tampón. La reacción de
marcaje de secuenciación se realiza mediante la PCR (Polimerase
Chain Reaction).
Análisis de Fragmentos
Los
analizadores genéticos que se encuentran en la Unidad, se basan
en electroforesis capilar y detección inducida por láser.
Estos equipos permiten además de la secuenciación
automática de DNA, realizar análisis genético
utilizando fluorescencia para detectar los fragmentos generados. Esta
metodología utiliza cebadores marcados fluorescentemente con los
mismos fluorocromos que se emplean para la secuenciación.
Mediante
un programa de análisis se detectan los diferentes fragmentos
que se ha generado. Este software es GeneScan que ofrece un
análisis sencillo y rápido ya que en una misma
inyección se pueden correr hasta 3 muestras distintas puesto que
al ir marcadas con fluorocromos distintos en el análisis se
discrimina por colores
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
La
PCR cuantitativa o en tiempo real se realiza en un equipo que integra
un PCR convencional y un espectrofluorímetro que determina la
fluorescencia que se produce en el tubo de amplificación en todo
momento a lo largo del proceso. El fluoróforo está
presente constantemente en el medio de la reacción y la
señal obtenida al final de cada ciclo de amplificación se
representa en una gráfica frente al número de ciclos y se
obtiene una curva que muestra el transcurso del proceso. El equipo
utiliza un láser para emitir la luz que excita al
fluoróforo y la tecnología de las cámaras de
diodos computerizadas (CCD) para determinar la fluorescencia emitida a
distintas longitudes de onda en función del fluoróforo
que se utilice. La cámara CCD es multicanal, lo que le permite
realizar varios análisis simultáneos en el mismo tubo de
PCR.
La
cuantificación se logra mediante el empleo de una curva
patrón en la que se representan las intensidades de
fluorescencia conseguidas frente a concentraciones iniciales conocidas
de un fragmento idéntico al que queremos cuantificar.
La
química que se utiliza en la detección es SYBR Green como
agente intercalante o la tecnología de las sondas marcadas
fluorescentemente, denominadas sondas TaqMan basadas en el
apantallamiento de energía entre un fluoróforo y una
molécula apantallante.
Electroforesis de DNA, RNA y proteínas en
Bioanalizador
La
electroforesis de DNA, RNA o de proteínas se realiza en un
equipo que permite el tratamiento de datos en un software, mostrando el
gel clásico y un electroferograma con las diferentes bandas. Al
mismo tiempo cuantifica cada una de las bandas mostrando su
tamaño, su concentración en ng/microlitro y molaridad. La
electroforesis tiene lugar en un soporte sólido (chip) que
consume únicamente 1 microlitro
de muestra. Con este equipo se evita la elaboración del gel y el
tratamiento con bromuro de etidio en el caso de electroforesis de DNA y
tinción y secado de geles en el caso de proteínas. Los
patrones de peso molecular vienen incorporados en el kit. La
electroforesis de proteínas se realiza siempre bajo condiciones
desnaturalizantes.
Electroforesis en gradiente desnaturalizante. DGGE
(Denatured Gradient Gel Electrophoresis)
La
DGGE es un método electroforético para identificar
cambios de una única base en un segmento de DNA. En este tipo de
electroforesis, la doble hebra de DNA se somete a una
desnaturalización creada mediante un gradiente formado por un
agente desnaturalizante y tiene lugar a una temperatura constante.
En
ésta electroforesis se someten los fragmentos de DNA a una
desnaturalización, en la que se detectan cambios de movilidad en
los fragmentos. Cada uno de los fragmentos alcanza una temperatura de
disociación denominada temperatura de melting y es
específica de secuencia. El DNA estará parcialmente
disociado, en un punto determinado del gradiente, creando
moléculas ramificadas, que permitan observar la diferencia
respecto de la disociación de un fragmento de DNA mutado de uno
que no lo está. La disociación parcial del DNA reduce su
movilidad en un gel de poliacrilamida. Puesto que la temperatura de
disociación es específica de secuencia, la presencia de
una mutación alterará el perfil de
unión/disociación de ese fragmento de DNA mutado respecto
del mismo fragmento sin mutar. El fragmento conteniendo la
mutación tendrá cambios en la movilidad respecto del DNA
original. Si el fragmento se desnaturaliza por completo, la
migración vuelve a estar en función del tamaño del
fragmento. La detección se realiza mediante tinción con
plata.
Este
equipo permite realizar otros ensayos electroforéticos como son:
Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE), Temporal Temperature
Gradient Gel Electrophoresis (TTGE), análisis de heteroduplex y
Single-Strand Conformational Polymorphism (SSCP).
Electroforesis en campo
pulsado. Sistema CHEF (Clamped Homogeneus Electric Fields)
La
electroforesis en un sistema CHEF se utiliza para el análisis e
identificación de fragmentos de DNA de un tamaño superior
a 2Kb. La resolución abarca desde DNAs de 100 pb. a 10
Mb.
Es
una técnica electroforética que permite resolver
tamaños de DNA del orden de cromosomas. La separación se
realiza mediante alternancia del campo eléctrico entre
diferentes pares de electrodos provocando una reorientación
continua de los fragmentos que migran a través de la agarosa. De
ésta forma se puede realizar la visualización del DNA de
elevado peso molecular. Para prevenir la rotura de las
moléculas de DNA, las células intactas se embeben en
bloques de agarosa que sirven como soporte para facilitar su
colocación en los pocillos de gel. La lisis y
desproteinización celular se realiza in situ. Así mismo
se puede llevar a cabo la digestión del DNA en el mismo bloque
de agarosa. En muestras líquidas de DNA de elevado peso
molecular de hasta 100 Kb, no se requiere preparación en bloques
de agarosa, y se pueden añadir en los pocillos con puntas de
pipeta de boca ancha.
La
detección de las bandas se realiza mediante tinción con
bromuro de etidio que actúa de forma intercalante.
Sistema de análisis de Imágenes TYPHOON 9410.
El
TYPHOON 9410 es un scanner diseñado para realizar la
detección y análisis de diferentes imágenes
obtenidas de ensayos con marcaje fluorescente principalmente. De
ésta forma se pueden visualizar geles y membranas procedentes de
ensayos tales como:
Southern/Northern
fluorescente, Western blooting quimiofuorescente, geles de
proteínas SDS page y 2-D, geles de cuantificación de
ácidos nucleicos, microarrays, diferential display, etc.. Los
reactivos de marcaje y detección deben ser los adecuados para
poder realizar la visualización fluorescente en el equipo.
Digestión de
proteínas
La digestión
enzimática es un técnica estándar usada como parte
del proceso de preparación de la muestra para su análisis
posterior por espectrometría de masas, por MALDI-TOF o nano-ESI
LC-MS/MS.
Las proteínas recuperadas de los geles de acrilamida son
digeridas de forma automática mediante el empleo de proteasas,
generalmente tripsina usando el Digestor de proteínas
Investigador TM ProGest (Genomic Solutions Cambridgeshire,
UK).
Brevemente, las bandas de gel se lavan con 25 mM de bicarbonato de
amonio y agua para eliminar las impurezas del colorante y del SDS,
antes de su reducción con 10 mM de DTT y alquilación con
100mM de yodoacetamida en 50 mM de bicarbonato amónico. A
continuación estas bandas se digieren con tripsina porcina
modificada (Promega, Madison WI) en 25 mM bicarbonato amónico
durante 6-7 horas a 37º C. Finalmente los péptidos
resultantes de la digestión de proteínas se extraen con
bicarbonato de amonio, después en 70% de actonitrilo y
finalmente en 1% de ácido fórmico.
Desalación
y concentración de muestras de proteínas por Zip-Tip
Los péptidos resultantes de la digestión extraídos
en 0.1% de fórmico se purifican y concentran mediante zip tips
(Agilent cleanup c 18 Pippette tips) con el fin de disminuir las
interferencias en los análisis de espectrometría de
masas. Dependiendo del número de muestras, el proceso de
desalación y concentración de muestras puede
automatizarse mediante el uso de la estación de trabajo Robot
multitarea Mod. Freedom EVO (TECAN), además de su uso para la
deposición de las muestras sobre la placa Maldi para su
análisis posterior por espectrometría de masas.
Identificación
de proteínas
La espetrometría de masas es una tecnología
analítica esencial en el contexto de la proteómica debido
a su alta capacidad de análisis, su sensibilidad y su
precisión en la determinación de las masas moleculares de
péptidos y proteínas, así como los espectros de
fragmentación que proporcionan información de secuencia.
La identificación de péptidos y proteínas en
mezclas complejas se asienta en dos estrategias básicas, el
denominado mapeo de masa péptidas mediante espectrometria de
masas y la secuenciación de péptidos mediante
espectrometría de masas en tándem. Dependiendo de las
características de las muestras a analizar en cada caso,
resultará más óptima la utilización de
equipos con características diferentes. En la unidad se disponen
de los siguiente equipos.
-Agilent 1100 series nano-HPLC en línea con un
espectrómetro de trampa de iones XCT plus (Agilent) equipado con
una fuente nano-ESI.
-Sistema de espectrometría de masas con analizador de tiempo de
vuelo y desorción mediante láser asistida por matriz
(MALDI-TOF), BRUKER Daltonics modelo Autoflex.
APLICACIONES
El equipamiento de que se dispone es el adecuado para
realizar el análisis de DNA de distintos organismos.
Mediante
la obtención de la secuencia de nucleótidos y con las
técnicas de genotipado se pueden realizar diferentes
aplicaciones entre las que se encuentran:
- Investigación
en microbiología para la identificación de especies.
- Identificación
de especies vegetales.
- Diagnóstico
de enfermedades.
- Análisis de
DNA antiguo.
- Investigación
básica en bioquímica y biología molecular.
Entre las múltiples aplicaciones de la PCR
cuantitativa están los ensayos de:
- Discriminación
alélica
- Expresión
génica/Cuantificación de RNA
- Detección
de SNPs (Single nucleotide polymorphisms)
- Detección
de patógenos/microorganismos (presencia/ausencia)
- Cuantificación
de OGMs
Identificación de proteínas de muestras
biológicas (clínicas, alimentos, cultivos microbianos,
plantas,....) mediante técnicas proteómicas.
SERVICIOS
- Secuenciación
de productos de PCR, plásmidos, fagos, etc. ABI PRISM 310 y 3100.
- Secuenciación
con cebadores universales disponibles en la Unidad.
- Análisis de Fragmentos (AFLPs, microsatélites,
análisis de DNA antiguo). ABI PRISM 310 y 3100.
-
Análisis Primer Extensión en analizador
genético. ABI PRISM 310 y 3100.
- Ensayos en un
equipo de PCR en tiempo real. ABI PRISM 7000.
- Cuantificación
y visualización de DNA, RNA y proteínas en un
Bioanalizador. AGILENT BIOANALYZER 2100.
- Aislamiento de
Plásmidos.
- Purificación
de productos de PCR.
- Almacenamiento de
muestras en un ultracongelador a –80°C. NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC.
- Ultracentrifugación
preparativa refrigerada alta velocidad. OPTIMA XL SERIES BECKMAN COULTER
- Centrifugación
refrigerada media velocidad. Centrífuga Avanti J-25 BECKMAN
- Análisis y
tratamiento de imágenes en un Scanner Typhoon 9410. Amersham
Biosciences.
- Digestión tríptica en gel procedente de
electroforesis mono ó bidimensional.
- Desalación y concentración de muestras usando
zip tips para su análisis posterior por espectrometría de
masas.
- Determinación del peso molecular de la
proteína intacta mediante MALDI-TOF.
- Obtención del mapa peptídico mediante
MALDI-TOF e identificación de proteínas en bases de datos
mediante huella peptídica (PMF) utilizando MASCOT, como
algoritmo de búsqueda.
- Identificación de proteínas mediante nano-ESI
LC-MS/MS:
- Identificación
de proteínas en mezclas senciallas LC-MS/MS (< 5
proteínas) y en mezclas de complejidad media LC-MS/MS (< 50
proteínas). Separación
previa de los péptidos trípticos mediante un sistema de
cromatografía nano LC y posterior análisis MS/MS. Para la
identificación de las proteínas basadas en espectros de
MS/MS se dispone de uns software de análisis (Spectrum Mill) que
se encuentra en el Servicio pudiéndose trabajar con él
desde cualquier punto de la Universidad de Alilcante. El
análisis de los resultados puede realizarse con otros motores de
búsqueda como Mascot y Phenyx.
- Identificación
de proteínas en mezlcas complejas 2DLC-MS/MS (2-5 fracciones) y
2DLC-MS/MS (> 5 fracciones). La complejidad de la muestra requiere
un pre-fraccionamiento de los péptidos trípticos
mediante un sistema de cromatografía "off-line" y analizar
posteriormente las fracciones mediante LC/MS/MS. Se recomienda
consultar previamente con el personal para diseñar la estrategia
más adecuada a cada tipo de muestra.
- Secuenciación
de novo. Este servicio se ofrece como suplemento a los servicios de
identificación de proteínas analizadas por MS/MS y
búsqueda basada en espectros MS/MS. Los espectros no asignados
se someterían a secuenciación de novo para su
interpretación en profundidad mediante el uso de la herramienta
del Sepectrum Mill que usa el algoritmo de la secuenciación de
novo de Sherenga. Especialmente útil en aquellos casos en los
que no se encuentra la secuencia completa del organismo en las bases de
datos.
CARACTERÍSTICAS, USO Y MANEJO DE LAS
CENTRÍFUGAS
- Ultracentrífuga
Optima XL Series de la Casa Beckman equipada con un rotor basculante
que alcanza como máximo 41000 rpm y con tubos de capacidad de 15
mL y un total de 6. Los tubos se encuentran disponibles en nuestra
unidad, existiendo dos tipos de material de éstos tubos,
polialomero y material Ultra-CL
Las tablas de
resistencia de los tubos a diferentes soluciones se muestra a
continuación:
Material
|
Ac.débil
|
Ac.Fuerte
|
Alcoholes
|
Aldehidos
|
Bases
|
Esteres
|
Polialomero
|
S
|
S
|
S
|
M
|
S
|
M
|
Ultra-Clear
|
S
|
No
|
No
|
S
|
No
|
No
|
Material
|
HidroC.alifáticos
|
HidroC.aromátic.
|
Cetonas
|
Ag.oxidantes
|
Sales
|
Polialomero
|
M
|
No
|
M
|
No
|
S
|
Ultra-Clear
|
No
|
No
|
No
|
No
|
S
|
S: Resistencia
satisfactoria M: Resistencia
media/dudosa No:
Resistencia No satisfactoria
- Centrífuga
refrigerada de alta velocidad, también de la Casa Beckman equipada con dos tipos de rotores, uno para
tubos de 50 mL hasta un total de 8 tubos que alcanza una velocidad
máxima de 25.000 rpm. y otro
rotor para tubos de 250 mL hasta un total de 6 que alcanza una
velocidad máxima de 14.000 rpm.
- Centrífuga
refrigerada sobremesa de la Casa Eppendorf equipada con 2 tipos de
rotores y con diferentes accesorios
para centrifugar distintos volúmenes.
Dispone de un rotor
fijo para tubos eppendorf y un rotor basculante para tubos tipo falcon
de 50 mL y de 15 mL,
además de un accesorio que permite centrifugar placas de
microtiter.
Los tubos los
traerá el usuario interesado.
La velocidad
máxima que alcanza cada uno de los rotores es:
- Rotor para tubos
eppendorf ______ 14000 rpm
- Rotor para tubos
falcon y placas microtiter _____ 4000 rpm
Para hacer uso de
cualquiera de las tres centrífugas será necesario
contactar con el personal de la Unidad, indicando la
hora-fecha aproximada de utilización, rotor a utilizar, si se
necesitan tubos o no, etc...
Para la puesta a punto de metodologías y ensayos
contactar con el personal de la unidad.
EQUIPAMIENTO
Equipos específicos
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- Analizador
Genético ABI PRISM 310. Applied Biosystems.
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- Analizador Genético ABI PRISM 3100. Applied
Biosystems (16 capilares) permite simultaneidad de las 2 aplicaciones.
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PCR Cuantitativo
ABI PRISM 7000 Sequence Detection System.
Applied Biosystems
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- Bioanalizador
AGILENT 2100 Bioanalyzer
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- Scanner Typhoon
9410. Amersham Biosciences.
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- Digestor de
proteínas Investigador TM ProgGest (Genomic Solutions
Cambidgeshire,UK).
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- Agilent 1100 series
nano-HPLC en línea con un espectrómetro de trampa de
iones XCT plus (Agilent) equipado con una fuente nano-ESI.
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- Robot multitarea Mod.
Freedom EVO (TECAN)
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- 2 Termocicladores GeneAmp PCR System 2400. Perkin Elmer (con
capacidad para 24 muestras)
- Termociclador
GeneAmp PCR System 9700. Applied Biosystems (con capacidad para 96
muestras)
- Electroforesis de
campo pulsado. CHEF-DR III. BIORAD.
Software
Se
encuentran disponibles diversos programas de tratamiento de datos que
pueden ser utilizados en nuestro laboratorio por los usuarios.
- Programas de
análisis y comparación de secuencias de DNA y
proteínas .
Sequencing ABI, Seqscape. - Programas de
análisis de fragmentos. Genescan ABI, Genotyper.
- Programa de
tratamiento de datos para el bioanalizador. Agilent 2100 Biosizing.
Biosizing Data evaluation.
- Programa de control para nano-ESI LC-MS/MS. Bruker Daltonics
Data Análisis, v.3.4. Permite el procesamiento de datos y
conversión de datoa a diversoso formatos, mgf y mzXML.
- Programa de análisis Spectrum Mill A 03.03.084 SR4
Agilent Tecnologies para identificación de proteínas
basadas en espectros de MS/MS (nano-ESI LC-MS/MS).
Equipos auxiliares
- Ultracongelador
NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC (con sistema de seguridad de CO2)
- Cabina de Flujo
Laminar Vertical TWO-30. FASTER
- Termostato de
Bloque metálico. SELECTA
- Concentrador-Evaporador
5301. EPPENDORF
- Vortex REAX 2000.
HEIDOLPH
- Centrífuga
Refrigerada Mod. 5810R con rotor basculante y rotor angular EPPENDORF
- Centrífuga
de sobremesa con cabezales intercambiables para tubos 0.2 mL, 0.5 mL y
1.5 mL. Microcentaur. SANYO
- Autoclave.
SELECTA, AUTOTESTER
- Ultracentrífuga
Preparativa OPTIMA XL SERIES. BECKMAN COULTER
- Sistema de
micropurificación de agua. Agua ultrapura (Milli-Q Biocel A10).
Millipore
- Escamas de hielo.
Modelo FB200A. CAROTTI ICE.
- Ultracentrífuga preparativa L-70 Beckman Coulter.
- Concentrador-Evaporador refrigerado para tubos y placas (mi
Vac concentrador range)
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EQUIPOS COFINANCIADOS POR LA
UNIÓN EUROPEA A TRAVÉS DEL FONDO EUROPEO DE DESARROLLO
REGIONAL.
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EXPERIENCIA
Se
viene realizando desde 1998 secuenciación de DNA mediante
electroforesis capilar y detección por fluorescencia inducida
por láser.
Además de
la secuenciación se han realizado estudios de análisis
genético en plantas mediante AFLPs.
Con la
adquisición de nuevos equipos se han ampliado las prestaciones
como se puede ver en el apartado de equipamiento.
Actualmente,
se están realizando múltiples aplicaciones en nuestra
unidad entre las que se encuentran además de la
secuenciación de DNA y análisis genético,
electroforesis de DNA y proteínas en un bioanalizador y
análisis del inicio de la transcripción mediante primer
extensión.
PERSONAL
Susana Díaz
González
Susana Sellés
Marchart
Sonia Gómez Vidal
Ana
Mª Alonso Díaz
E-mail Unidad: GenoProt.sti@ua.es
Tfno: 965903400 Ext. 9717/ 2022
Fax: 965903643
NORMATIVA
Solicitud de Servicios
Cumplimentar la hoja de solicitud de servicio y presentar
junto con las muestras.
Para los servicios de proteómica cumplimentar la hoja
de solicitud de servicio o realizar la solicitud a través de
proteored (www.proteored.org).
En el entorno de proteored la UA oferta los servicios de Electroforesis
2D y canaliza la solicitud a través de www.proteored.org/Services.asp.
Será
requisito indispensable rellenar un impreso de recepción de
muestras cuando se desee solicitar un servicio. El impreso
deberá ir firmado por el responsable de un centro de gasto
de la Universidad, al cual se le cargará el coste del servicio
utilizado. Si el solicitante es externo a la Universidad deberá
indicar CIF y dirección completa de la empresa solicitante.
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Para solicitar otros análisis contactar con el
personal de la Unidad.
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REQUISITOS
DE LAS MUESTRAS
Para secuenciación
La
secuenciación se puede realizar con cebadores del usuario o con
los universales disponibles en la Unidad.
DNA
|
Concentración
mínima
|
Cantidad máxima
|
Producto de PCR
|
50 ng / microlitro
|
100 - 200 ng
|
Plásmidos
|
200 ng / microlitro
|
1.00 - 3.00 microgramos
|
Fagos
|
300 ng / microlitro
|
1.5 - 4.00 microgramos
|
El DNA debe estar purificado antes de la reacción de
secuenciación y resuspendido en agua ultrapura estéril.
Se traerá en un tubo eppendorf etiquetado con el nombre, fecha y
concentración estimada.
Cebador
|
Concentración
máxima
|
Cualquier cebador
|
5 - 10 micromolar
|
El cebador ha de estar en un tubo eppendorf debidamente etiquetado
indicando nombre, fecha y concentración.
Cebadores disponibles.
M13 Forward: 5’ CGA CGT
TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3’
M13 Reverse: 5’ GGA ATA
CGA CTC ACT ATA GGG C 3’
T3 Prom: 5’ TAA CCC TCA
CTA AAG GGA 3’
T7 Prom: 5’ GTA ATA CGA
CTC ACT ATA GGG C 3’
Para análisis de fragmentos
El DNA debe estar
resuspendido en agua.
Enviar
al menos 20 microlitros de la reacción de PCR en la que se ha
efectuado la reacción de amplificación.
Indicar el rango
de tamaños esperado para los fragmentos.
Indicar los
fluorocromos utilizados en el marcaje de los cebadores.
Para PCR cuantitativa
Dependiendo del
tipo de ensayo a realizar, consultar con el personal.
Para Electroforesis en
Bioanalizador
Para
realizar electroforesis de DNA, RNA o proteínas se deben
presentar las muestras en un tubo eppendorf etiquetado con nombre,
fecha y volumen.
MUESTRAS DE RNA
Para muestras de RNA total debe tener una concentración de 5-500
ng/microlitro
Para muestras de mRNA
debe contener una cantidad de 25-500 ng/microlitro.
La concentración máxima del tampón de
muestra debe ser de 10mM tris-EDTA.
Se utiliza 1 microlitro de muestra.
Chip con una
capacidad de 12 pocillos.
MUESTRAS DE DNA
Existen diferentes chips dependiendo del tamaño de
DNA que se quiera visualizar.
La concentración
de DNA a analizar ha de estar comprendida entre 0.5-50 ng/microlitro.
El rango de los
fragmentos a visualizar ha de estar comprendido en los rangos de cada
uno de los chips.
Chip DNA 1000. Fragmentos en un rango de 50-1000 bp
Chip DNA 7500.
Fragmentos en un rango de 100-7500 bp
La
concentración máxima de sal en las muestras debe ser de
125 mM KCl o 15 mM MgCl2. Se utiliza 1 microlitro de muestra.
Chip con una capacidad de 12 pocillos.
MUESTRAS DE PROTEÍNAS
El tamaño de las proteínas a visualizar ha de
estar comprendido entre 14-200 kDa.
La concentración
debe estar entre 40-4000 ng/microlitro.
Se utilizan 4 microlitro de muestra.
Chip con una
capacidad de 10 pocillos.
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| Detergentes |
Sales |
Otros aditivos |
Tampones |
2 % Dodecyl beta
multicicle (6)
|
500 mM NaCl |
4 M urea
7 M urea |
100 mM Tris-HCl |
0.5%
zwittergen E3-14 (6)
|
300 mM NH4HCO3
pH 8 |
600 mM guanidine
(1) |
10 mM sodium
phosphate |
| 0.1 % Tween 20
Tween 80 |
300 mM KCl
(1)
600 mM KCl |
20% ethanol |
100 mM MOPS |
1% Triton X-100 (6)
|
20 mM NaAc |
100 mM DTT |
25 mM PIPES |
1 % Sarcosyl (5)
|
25 mM NaF |
30 % glycerol |
PBS (Dulbeco’s) |
1% SDS (6)
|
|
0.04 % NaN3 |
250mM Tris /
20 mM glycine |
1% CHAP (4-6)
|
Azúcares |
0.1% TFA (2-3)
|
20 mM phosphate
/
15 mM NaCl |
|
4% w/w sucrose
200 mM sucrose |
1 % PEG 3350
(polyethylenglycol) |
150 mM Nacitrate /
100 mM Tris |
|
5 % mannitol |
250 mM imidazole |
50 mM MES |
|
|
10 mM EDTA |
100 mM
Tris-bis-propane, pH 8 |
|
|
Protease
inhibitor
cocktail
(100x diluted
Sigma) |
25 mM HEPES / 150
mM NaCl |
|
|
20% ACN (3)
|
50 mM NaH2PO4,
300 mM NaCl,
250mM Imidazole |
|
|
|
10 mM HEPES |
(1) Precipita SDS
(2) Cambia la migración de albúmina, debe ser
evaporada.
(3) Puede precipitar SDS, debe ser evaporada
(4) Da señal baja, el marcador superior desaparece
(5) Aparece un pico negativo entre 14-19 kDa
(6) Da un pico que se superpone con el marcador inferior
afectando a la signación de tamaño.
Para aislamiento de DNA plasmídico
El
usuario deberá entregar en el servicio el pellet de un cultivo
bacteriano de 2 a 5 microlitro incubado durante la noche.
El tubo eppendorf
debe ir etiquetado debidamente indicando nombre, fecha y volumen desde
el que se ha obtenido el pellet.
Para purificación de
productos de PCR
El usuario deberá entregar en el servicio como
mínimo 20 microlitros
de la reacción de PCR que se desea purificar. El tubo eppendorf
debe ir etiquetado debidamente indicando nombre, fecha y volumen de la
reacción de partida.
Para digestión
de proteínas con Progest
No se admitirán muestras que no cumplan las
siguiente especificaciones:
- Las proteínas
deberán proceder de geles de poliacrilamida que se hayan
teñido posteriormente a la electroforesis.
- Las muestras se
suministrarán cortadas en spots de diámetro inferior a 2
mm en un rack rosa de reacción de 96 pocillos. Al finalizar la
digestión de las proteínas los péptidos
resutlantes se eluyen sobre un rack azul de colección de 96
pocillos y se entregarán al usuario quien se encargará
del procesado posterior previo al análisis por Maldi-Tof o
nano-ESI LC-MS/MS de las muestras, a menos que se solicite la
desalación y concentración de las muestras por zip-tips.
- En ningún caso se
aceptarán bandas procedentes de estándares
comerciales preteñidos.
- Se procesarán
como mínimo dos muestras, y siempre en número par.
Se recomienda:
- Dejar al menos una
posición para procesar un blanco (sin gel), que el usuario debe
localizar en el esquema de la placa que se adjunta con el impreso.
- Digerir junto con las
muestras un spot correspondiente a un estándar de peso molecular
conocido que se haya corrido en un carril paralelo a la muestra.
La
placa rosa, azul y film, será suministrada al usuario por el
personal responsable del equipo. La manipulación de estas placas
debe realizarse siempre con guante de látex sin polvo, para
evitar la contaminación de las muestras por queratinas.
Para análisis Nano ESI-LC-MS/MS proteómica
Preparación de
la muestra:
-
La
manipulación de las muestras debe realizarse siempre con guantes
de látex sin polvo, para evitar la contaminación de
muestras por queratinas.
-
Las
muestras digeridas
procedentes de spots o de bandas se resuspenderán en agua de
calidad HPLC con 3% de ACN y 0.1% de ácido fórmico
(volumen mínimo 10µl).
-
Las
muestras digeridas en
solución deberán contener un 0.1% de ácido
fórmico. La concentración de las muestras procedentes de
digestión en solución no deberá exceder de 0.5 g
para evitar background en el sistema.
Será
aconsejable acompañar junto con las muestras un spot
correspondiente a un estándar de peso molecular conocido
previamente digerido que se haya corrido en un carril paralelo a la
muestra.
Entrega de resultados
Los resultados se entregan como:
1. cromatograma en papel
2. disquete o CD
3. e-mail
Los datos de las secuencias se recogerán en la Unidad.
El programa para
visualizar los ficheros de los cromatogramas ABI Prism 310 y 3100 se
encuentra disponible en: chromas
Los resultados obtenidos para las muestras analizadas para nano
ESI-LC-MS/MS se incorporan al servidor que dispone de un software de
análisis (Spectrum Mill) pudiéndose trabajar con
él desde cualquier punto de la Universidad de Alicante.
Los resultados pueden darse a los usuarios en otros formatos, mgf y
mzXML para realizar el análisis con otros motores de
búsqueda como Mascot y Phenyx.
Para recoger y
analizar los resultados de otras aplicaciones consultar con el personal
de la unidad.
A
la entrega de las muestras, el usuario firmará el parte de
trabajo, disponible en el Servicio. Copia del mismo será
remitido a la Secretaría de su Departamento una vez finalizado
el análisis solicitado y en él se detallará el
importe del servicio y concepto del mismo.
No
se procesarán aquellas muestras que no se acompañen de
los mencionados impresos debidamente cumplimentados y firmados.
Una vez entregados
los resultados el servicio guardará el DNA, los ficheros,
etc...durante un mes.
Resultados erróneos
Los reactivos y
los procedimientos empleados son los adecuados para minimizar la
frecuencia de resultados erróneos.
No obstante se pueden dar fallos debidos a diferentes causas:
1. Características de las muestras (molde y/o
iniciadores)
2. Información insuficiente por parte del usuario
3. Error operativo (funcionamiento interno del servicio)
Las causas de error más habituales asociadas al
material de partida son:
- Cantidad insuficiente de muestra.
- Calidad o purificación insuficiente de la muestra.
- Problemas diversos con el cebador específico
(concentración, diseño, Tm empleada...)
- Problemas relacionados con el tampón de
resuspensión de las muestras.
Nota importante
Las
muestras fallidas se repetirán por propia iniciativa del
servicio sólo cuando se considere probable que se trata de un
error operativo. Si la repetición volviera a fallar se
asumirá que no era error operativo, en cuyo caso se
cobrará la muestra fallida.
En caso de que
el error sea operativo, las reacciones fallidas no se cobrarán.
El correcto funcionamiento
del nano ESI-Lc MS/MS se realiza mediante el análisis
periódico de controles de albúmina (50fmol). Solo se
analizan muestras de clientes si el control de albúmina pasa las
especificaciones. Por ello los análisis de muestras de clientes
fallidos se facturarán igual que los exitosos, a menos que
hubiera ocurrido algún mal funcionamiento del instrumento
durante el análisis de las muestras.
Las muestras también se podrán repetir si el
usuario lo solicitase.
ENLACES DE INTERÉS
Software
Programa para visualizar los electroferogramas de secuencias
de DNA. Chromas.exe
Programa para visulizar
los electroferogramas de secuencias de DNA Sequence
Scanner Software v1.0
Programa para visualizar los electroferogramas de análisis de
fragmentos GeneSanView
Bases de datos de secuencias del EMBL
y GenBank
Paquete
informático para análisis de secuencias Expasy
Base
de datos de secuencias de NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)
Centros de investigación
Centro
de
Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)
Centro de
Investigaciones
Biológicas (CIB)
Centro
Nacional de
Biotecnología (CNB)
Instituto
de
Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA)
Institut
de
Biología Molecular de Barcelona (IBMB)
Instituto
de Biología y Genética Molecular (IBGM)
Instituto
de Investigaciones Biomédicas (IIB)
Centro
Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)
Instituto
Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)
Centro de
Investigación Príncipe Felipe
Instituto
Tecnológico Agroalimentario (AINIA)
Sociedades, redes y protocolos
Sociedad
Española de
Bioquímica y Biología Molecular
Sociedad
Española de
Microbiología
Red
Valenciana de Genómica y Proteómica
Compendio
de sitios Web con recursos de Biología
Molecular
Protocolos de Biología Molecular en Internet
ASEBIO.
Asociación
Española de Bioempresa
SLAGF.
Sociedad
Lationamericana de Genética Forense
ProteoRed,
Instituto Nacional de Proteómica
Genoma
España,
Fundación para el desarrollo de la Investigación en
Genómica y Proteómica
SeProt,
sociedad Española de Proteómica
S.E.E.M.
Sociedad
Española de espectrometría de masas
EuPa,
European
proteomics association
HUPO,
Human Proteome
Organisation
Revistas Científicas
Biotechniques
Revistas
electrónicas en la UA
http://us.expasy.org
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