FUNDAMENTOS
DE LA TÉCNICA
En la microscopía confocal se reconocen estructuras
en las que
la luz emitida o reflejada por una muestra se concentra en un solo
plano focal y se superpone a toda luz que no procede de dicho plano.
En un barrido puntual confocal, las lentes del microscopio
enfocan la
luz láser sobre un solo punto de la muestra (el punto focal). A
continuación, el láser explora la muestra punto por punto
y genera la imagen barrida. La fluorescencia y la luz reflejada por la
muestra vuelven atravesando el objetivo. El microscopio y el sistema
óptico del módulo de barrido enfocan la luz emitida por
el punto focal sobre un segundo plano, el punto confocal. A
través de la pequeña abertura de este punto (denominada
pinhole), la luz del punto focal llega hasta el detector. La luz que no
procede de este foco no atraviesa la abertura.
El principio confocal se representa de forma
esquemática para la
microscopía de epifluorescencia. Como en otros microscopios de
epifluorescencia, la lente se utiliza al mismo tiempo como condensador
y como objetivo. La gran ventaja es que desaparece la necesidad de
equilibrar dos lentes con exactitud y ajustarlas entre sí. Un
difusor de rayos (un espejo dicroico) refleja el rayo láser
colimado y polarizado que se introduce a través de una ranura
sobre la parte trasera de la lente del objetivo y lo enfoca sobre la
muestra. La luz que refleja la muestra vuelve a atravesar la misma
lente. El rayo de luz se enfoca a través del pinhole (es decir,
la ranura confocal) para excluir, de esta forma, la luz extrafocal, es
decir, la emitida por zonas de la muestra que están por encima o
por debajo del plano focal. El volumen del corte óptico depende
de diferentes parámetros como el diámetro (variable) de
la abertura y la longitud de onda. Un detector sensible a la luz (por
ejemplo un fotodiodo) colocado tras la abertura confocal registra los
datos intrafocales de cada punto de la muestra. La señal de
salida analógica se digitaliza y se transmite a un ordenador.
El detector consiste en un detector puntual que sólo
recibe la
luz de un punto de la muestra. De esta forma, el microscopio confocal
permite observar sólo un punto de la muestra en cada momento, a
diferencia del microscopio convencional con el que puede verse una zona
mayor de la muestra. Así, la imagen completa de la muestra
sólo se consigue mediante la exploración punto por punto
de ésta, para lo cual debe desplazarse el punto luminoso o la
muestra. Ambas posibilidades han conducido al desarrollo de dos tipos
diferentes de microscopios confocales:
-
Microscopios con platina móvil
(barrido en etapas): la platina con la muestra se desplaza un poco tras
cada exposición mientras que el sistema óptico permanece
quieto.
-
Microscopios con técnica de rayo o de
espejo: el punto luminoso se desplaza sobre la muestra que se encuentra
fija y la recorre punto por punto con ayuda de pequeños y
rápidos espejos accionados mediante un galvanómetro como
los que utiliza Leica.
El sistema TCS SP2 de Leica permite crear un solo plano
focal,
así como toda una serie de planos (horizontales o verticales).
Un corte único vertical o un barrido xz, ofrece una vista
lateral de la muestra.
La recogida de una secuencia de cortes ópticos de la
muestra
como lote de imágenes y su posterior procesamiento digital
presenta la ventaja de que este bloque de datos de varias dimensiones
permite generar una imagen bidimensional calculada (proyección)
o una representación reducida en 3 dimensiones de la muestra en
un ordenador apropiado.
Poder resolutivo óptico
El término resolución hace referencia a la
capacidad de
distinguir entre los detalles más precisos de una estructura. En
un microscopio ideal, el sistema óptico estaría libre de
todo tipo de aberraciones. En este instrumento hipotético, el
poder resolutivo estaría limitado exclusivamente por la
difracción. Ésta puede definirse como la distancia
más pequeña entre dos puntos de una muestra a la que
éstos puntos pueden verse siempre como puntos separados
(criterio Rayleigh). A partir de éste límite, ambos
puntos se fusionan entre sí (es decir, los aros de
difracción se superponen de forma parcial o total) y no pueden
reconocerse como dos puntos independientes. Esta distancia se
calcula a partir del tamaño de una imagen de difracción
de un punto minúsculo de la muestra. Corresponde al radio del
primer mínimo de esta imagen de difracción. Esto, a
su vez, depende de la apertura numérica del objetivo y del
condensador. La apertura numérica se define mediante el
coeficiente de refracción de la lente y el tamaño del
compás de vara que puede penetrar. De forma análoga la
argumentación anterior, la resolución axial puede
definirse como el radio del primer mínimo a lo largo del eje del
microscopio de la imagen de difracción de un objeto puntual.
De acuerdo con la teoría de imágenes de
difracción
en 3 dimensiones de este tipo, el poder resolutivo a lo largo del eje z
es dos veces menor que el poder resolutivo óptico lateral. De
esta forma, la resolución óptica a lo largo del eje z
alcanza aproximadamente la mitad de la resolución del plano
focal. El microscopio TCS SP2 de LEICA consiste en un sistema de
barrido de puntos con gran sensibilidad y resolución
teórica en los ejes x, y, z, que no acepta condiciones. La
resolución de barrido se refiere a la nitidez de enfoque que
está determinada por el número y el tamaño del
píxel. Cuanto mayor es el número de píxeles y
mayor el formato de barrido seleccionado, más sencillo resulta
distinguir entre dos objetos próximos entre sí. La
resolución de barrido está limitada por el poder
resolutivo óptico máximo.
Detección
La formación de imágenes confocales, es decir,
la
medición de las características ópticas de
cantidades muy pequeñas de una muestra no está limitada
únicamente por la calidad óptica del microscopio. Otras
limitaciones son:
-
El hecho de que las muestras continuas se miden
(debido a la toma de muestras y al procesamiento digital) sólo
en pequeñas cantidades individuales de muestra.
-
La exactitud con la que se definen estas
pequeñas cantidades, que se determina mediante el mecanismo de
barrido.
-
La potencia de la fuente de luz en relación
con el potencial de reflexión de la muestra.
-
La sensibilidad y el ruido del detector.
También el detector es un componente central del
microscopio
confocal. Debido a su elevada relación entre señal y
nivel de ruido, LEICA Microsystems Heidelberg utiliza
fotomultiplicadores como detectores.
Edición de imagen
En los primeros microscopios confocales, el detector estaba
conectado a
un osciloscopio con fosforescencia y la imagen se mostraba de la forma
en que se producía el barrido. En la actualidad, en primer lugar
se procesa la señal digitalmente y después se muestra en
un ordenador. De esta forma existe la posibilidad de modificar la
imagen mostrada de diferentes formas. Las posibilidades son las
siguientes:
-
Incremento del contraste mediante valores
umbral, extensión de contraste lineal y la corrección
Gamma (curva del valor de intensidad de la imagen frente a la
representación gráfica de la intensidad de la fuente).
-
Doble exposición de imágenes en
experimentos.
-
Filtro digital para la ampliación de los
bordes, el alisado, la eliminación de interferencias, etc.
-
Reconstrucción de vistas
tridimensionales con ayuda de cortes ópticos recogidos en lotes
de imágenes. Esto permite, por ejemplo, la reconstrucción
de una imagen en un plano xz mediante lotes de imágenes de
planos xy. Al mismo tiempo, pueden generarse modelos tridimensionales
completos de la muestra y examinarse desde cualquier dirección.
-
Composición de películas digitales
mediante las series temporales tomadas con el microscopio.
Cuantificación y mediciones
Este tipo de edición de imágenes no incrementa
la calidad
de los datos recogidos; sin embargo, permite mejorar la vista y
facilitar la interpretación cualitativa de los datos.
Fuente luminosa
El láser se adapta como fuente luminosa de forma
excepcional a
la microscopía confocal, ya que proporciona una luz muy clara y
el rayo presenta una desviación muy pequeña. Al mismo
tiempo, su enfoque es sencillo y su intensidad muy estable.
Precisamente esta estabilidad cobra especial importancia en las
mediciones cuantitativas.
Integración
El TCS SP2 de Leica está concebido como sistema
integral. Todos
los elementos ópticos y mecánicos trabajan de forma
continua con el hardware y el software del ordenador. El Leica Confocal
Software incluido con el microscopio permite todo el proceso de
generación de imágenes, desde los cortes ópticos,
pasando por la edición y el análisis de las
imágenes (la principal aplicación del software) hasta la
impresión de las imágenes creadas mediante una impresora.
APLICACIONES
Las aplicaciones de la
técnica son muy numerosas
principalmente dentro de las ciencias biológicas:
biología celular, biología molecular, fisiología,
etc. Ya que permite identificar y localizar componentes moleculares
específicos con la particularidad de que al no ser una
técnica destructiva permite una observación in vivo.
Dentro de la ciencia de materiales también encuentra
aplicación en la observación de la morfología o
los defectos en sólidos como componentes
microelectrónicos, polímeros, resinas, depósitos,
minerales, cerámicas, metales, etc
Retina.
Cortesía del Dr. Nicolás Cuenca.
Dep. Biotecnología |
 |
REQUISITOS
Y LIMITACIONES
En general las muestras a observar en el microscopio
confocal deben ser
planas, bien sean cortes de material biológico o muestras
pulidas de materiales sólidos. El microscopio es invertido por
lo tanto las muestras deben ir provistas de un cubreobjetos de 0.17 mm.
De este modo se optimiza el funcionamiento de los objetivos al mismo
tiempo que se protegen. En el caso de cultivos o disoluciones
éstos deben estar contenidos en un recipiente (tipo placa Petri)
cuyo fondo sea de 0.17 mm de grosor, lo que equivaldría al
cubreobjetos en el caso de cortes.
DESCRIPCIÓN
DEL EQUIPO
El
microscopio láser confocal con el que cuenta la unidad es de
la marca LEICA. Es un microscopio confocal espectral. Cuenta con un
microscopio invertido DM IRBE2 para campo claro en luz transmitida y
fluorescencia en luz incidente con una dotación óptica
para contraste interferencial. Lleva tres filtros de fluorescencia:
- I3
(excitación azul BP 450-490; emisión LP 515) para FITC,
Cy2, etc.
- N2.1
(excitación verde BP 515-560;
emisión LP 590) para TRITC, Cy3, etc.
- A
(excitación UV BP 340-380;
emisión LP 425) para AMCA o DAPI, etc.
El microscopio tiene cinco objetivos, dos de ellos secos 10x
y 20x y
tres de inmersión 40x, 63x y 100x.
| El módulo confocal espectral SP2 es
un módulo con sistema de detección espectral altamente
sensible en el rango de 400 a 850 nm. Tiene tres canales de
detección para luz reflejada o fluorescencia. El sistema incluye
tres fuentes de láser: Rojo (HeNe 633 nm), Verde (HeNe 543 nm) y
Azul (Ar 458 nm, 476 nm, 488 nm y 514 nm). |
|
La platina del microscopio es galvanométrica de alta
precisión y alta velocidad para controlar el eje Z.
Existe también un detector de luz transmitida para registrar
imágenes de campo claro mediante el módulo confocal.
|
EQUIPO
COFINANCIADO POR LA UNIÓN EUROPEA A TRAVÉS DEL FONDO
EUROPEO
DE DESARROLLO REGIONAL
(FEDER)
|
|
EXPERIENCIA
DEL EQUIPO
Se han llevado a cabo análisis de muestras tanto
biológicas como de ciencia de materiales. Entre las muestras
biológicas cabe destacar el análisis de retinas y
bacterias. Entre las muestras de ciencia de materiales se ha estudiado
la superficie de materiales compuestos.
PERSONAL
Dra. Cristina Almansa Carrascosa
Tel: 96590 9713
Fax: 96590 3643
|
