FUNDAMENTOS
DE LA TÉCNICA
Cuando un haz de electrones incide sobre
la superficie de un sólido, tienen lugar varios
fenómenos: reemisión de una parte de la radiación
incidente, emisión de luz, electrones secundarios y Auger,
rayos X, etc. Todas estas señales se pueden emplear para obtener
información sobre la naturaleza de la muestra
(morfología, composición, estructura cristalina,
estructura electrónica, etc.) y de hecho, los dos
microscopios electrónicos de barrido con los que cuenta los
Servicios Técnicos de Investigación, JEOL JSM-840 e
HITACHI S-3000N, disponen de detectores que permiten el análisis
de electrones secundarios electrones retrodispersados y rayos X
característicos.
La técnica consiste, principalmente, en enviar un haz
de
electrones sobre la muestra y mediante un detector apropiado registrar
el resultado de esta interacción. El haz se desplaza sobre la
muestra realizando un barrido en las direcciones X e Y de tal modo que
la posición en la que se encuentra el haz en cada momento
coincide con la aparición de brillo, proporcionalmente a la
señal emitida, en un determinado punto de una pantalla.
Las imágenes que se obtienen en el microscopio
electrónico de barrido corresponden a electrones secundarios o
electrones retrodispersados emitidos tras la interacción con la
muestra de un haz incidente de entre 5 y 30 KeV.
La señal de electrones secundarios se forma en una
delgada capa
superficial, del orden de 50 a 100 Å. Al ser grande el
número de electrones emitido se puede establecer un buen
contraste. Por otra parte, al ser electrones de baja energía,
menos de 50 eV, pueden ser desviados fácilmente de su
trayectoria emergente inicial, y se puede obtener información de
zonas que no están a la vista del detector. Esta particularidad
es fundamental para otorgar a esta señal la posibilidad de
aportar información “en relieve”. La apariencia de la imagen es
la que tendría una muestra que hubiese sido iluminada desde el
detector y se estuviese observando desde el cañón de
electrones.
En cuanto a la señal de electrones retrodispersados,
su
principal utilidad reside en que su emisión, que se debe a
choques de tipo elástico y por tanto con energía del
mismo orden que la de los electrones incidentes, depende fuertemente
del número atómico de la muestra. Esto implica que dos
partes de la muestra que tengan distinta composición se revelan
con distinta intensidad aunque no exista ninguna diferencia de
topografía entre ellas. Los electrones retrodispersados salen de
la muestra en mayor cantidad en las direcciones próximas a la de
incidencia, por lo que su detección se hace mejor en las
proximidades del eje de incidencia.
Finalmente, los Rayos X que se generan en una muestra
sometida a
bombardeo electrónico permiten identificar los elementos
presentes y establecer su concentración. Cuando una haz
electrónico suficientemente acelerado incide sobre la superficie
de un sólido, se produce la ionización de los
átomos presentes, esto es, la pérdida de electrones
internos. En este estado un electrón de una capa más
externa salta inmediatamente a la capa deficitaria, y rellena el hueco
producido. Este salto implica una liberación de energía,
cuyo valor es igual a la diferencia entre las energías que
tenía cada electrón en su orbital correspondiente. Esta
energía se manifiesta de dos formas: electrones Auger o rayos X
y es única para cada elemento. Cuando se representa la
intensidad de esta radiación electromagnética frente a su
energía se obtiene un espectro de rayos X, constituido por una
serie de picos, designados como líneas, de intensidad variable,
a los que se denomina rayos X característicos, que está
superpuesto a un fondo continuo de menor intensidad (Rayos X
continuos). En algunos casos aparecen además unas líneas
satélite, asociadas a las líneas características.
APLICACIONES
Las aplicaciones de la técnica
son muy numerosas tanto en Ciencia de Materiales, como en Ciencia
Biomédica.
Dentro de la Ciencia de Materiales destacan las aplicaciones en
metalurgia,
petrología y mineralogía, materiales de
construcción,
materiales cerámicos tradicionales y avanzados,
electrónica,
fractografía y estudio de superficies y composición
elemental
de sólidos en general. La microscopía electrónica
de barrido también se aplica en botánica, en el estudio
de
cultivos celulares, en dermatología, en
odontoestomatología
y biomateriales, en hematología, inmunología, y en el
estudio
de la morfología de preparaciones biomédicas en
general.
Polen de Vrisea Incurvanta Fam.
Bromeliaceae
Cortesía de Mario Martínez Azorín |
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Radiolario
Cortesía
de José Enrique Tent Manclus.
Dep.
Ciencias de la Tierra |
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REQUISITOS
Y LIMITACIONES
Es
fundamental que las muestras que vayan a ser observadas en MEB
estén exentas de líquidos y además que sean
conductoras.
Secado de las muestras:
Las muestras que quieran ser investigadas mediante microscopía
electrónica de barrido deben ser secadas antes de ser
introducidas en el microscopio, de otro modo la baja presión en
el mismo causará que el agua (y otros líquidos
volátiles) se evapore saliendo violentamente del
espécimen y alterando la estructura del mismo. Muestras con una
rigidez inherente como metales, rocas, huesos, etc. se pueden secar al
aire o en un desecador de vacío sin que su estructura sufra
alteración alguna. Sin embargo, las estructuras blandas con un
alto contenido en agua se deformarán si se dejan secar al aire
ya que las fuerzas de tensión superficial asociadas a la salida
del agua causarán daños estructurales. Para evitar los
efectos dañinos que las fuerzas anteriormente mencionadas tienen
en la estructura de los especimenes secados al aire, durante el proceso
de secado debe pasarse el límite entre la fase
“líquido-gas”. Entre los métodos que existen para
conseguirlo se encuentra el método del punto crítico en
el cual el líquido pasa directamente a la fase gas. De este modo
las fuerzas de deformación se evitan debido a que el proceso de
secado tiene lugar por encima del punto crítico del
líquido, donde el límite entre la fase líquida y
la fase gas no existe.
El punto crítico es aquel estado particular de un gas en el cual
todavía puede sufrir licuefacción. Este estado
viene determinado por la presión crítica y la temperatura
crítica. Por encima de este punto el gas no puede experimentar
licuefacción debido a que el límite entre la fase gaseosa
y la fase líquida ha desparecido: En este punto el estado
líquido y el estado gas son igualmente densos. Éste es el
punto crítico. El líquido pasa a la fase gas sin pasar
por el límite de fases “líquido-gas”, y la muestra se
seca sin los efectos dañinos del secado en aire.
Según los valores de presión y temperatura crítica
del agua, 228.5 bar y 374 ºC, si un espécimen contiene agua
no puede ser secado mediante el método del punto crítico
ya que los valores tan altos de presión y temperatura
podrían destruirlo. Así la muestra debe ser
transferida a un agente apropiado, llamado fluido transicional, tal
como es el dióxido de carbono cuyos valores de punto
crítico son considerablemente más ventajosos, 73.8 bar y
31 ºC.
Recubrimiento de las muestras no conductoras:
Cuando se desea visualizar una muestra en un microscopio
electrónico de barrido ésta debe ser conductora ya que,
de no ser así, se carga durante la irradiación por una
acumulación de carga que desvía el haz electrónico
y, como consecuencia de ello aparecen distorsiones en la imagen.
Una solución a este problema es recubrir la muestra con una
película conductora, de espesor comprendido entre 10 y 25 nm.
Las técnicas empleadas para mejorar la conductividad de las
muestras para su estudio al microscopio electrónico de barrido
son la evaporación térmica y el recubrimiento por
sputtering. Ambas conducen a los mismos resultados pero los mecanismos
son distintos.
La elección del material con el que se va a recubrir la muestra
dependen fundamentalmente del estudio que se va a realizar. Así,
para la observación de imágenes de electrones secundarios
el oro y el oro-paladio son los materiales que conducen a los mejores
resultados; al ser elementos pesados, producen mayor
emisión. Cuando lo que se pretende es realizar un estudio
microanalítico es recomendable emplear carbono. El bajo
número atómico de este elemento lo hace
prácticamente transparente a los rayos X emitidos por la
muestra. También se emplean, a veces, aluminio, cromo, etc.
El depósito de películas metálicas se puede
realizar tanto por evaporación térmica como por
sputtering, pero cuando se recubre con carbono se utiliza habitualmente
la evaporación térmica.
DESCRIPCIÓN
DEL EQUIPO
Los dos microscopios electrónicos de barrido con los que se
cuenta son:
JEOL JSM-840
El
microscopio consta de un detector de electrones secundarios tipo
centelleador-fotomultiplicador con resolución de 4 nm, un
detector de
electrones retrodispersados tipo Si P-N con resolución de 10 nm
y un detector
de rayos X tipo UHV Dewar Si(Li) de Bruker para
microanálisis (EDS),capaz
de detectar elementos de número atómico comprendido entre
los del C y el U.
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Para la observación de muestras en este equipo los requisitos
son que éstas tengan ausencia de líquidos y que
estén recubiertas con material conductor si no son conductoras.
HITACHI S-3000N
El equipo
consta de un detector de electrones secundarios tipo
centelleador-fotomultiplicador con resolución de 3.5 nm, un
detector de
electrones retrodispersados tipo semiconductor con
resolución de 5 nm y
un detector de rayos X tipo XFlash 3001 de Bruker para
microanálisis (EDS) y
mapping, capaz de detectar elementos de número atómico
comprendido entre los
del C y el U.
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Además el equipo dispone del modo de
trabajo en presión variable (para observación de muestras
no
conductoras sin necesidad de recubrirlas con material conductor).
Acoplada al microscopio se encuentra la
unidad de criomicroscopía Oxford CT 1500 Cryostation mediante la
cual
se puede observar material biológico fresco sin tratarlo
previamente
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Para la observación de muestras en este equipo los requisitos
son que éstas tengan ausencia de líquidos y que
estén recubiertas con material conductor, si no son conductoras,
cuando se trabaje en el modo de alto vacío; no será
necesario en cambio cuando se trabaje en el modo de presión
variable o bien con la unidad de criomicroscopía.
El instrumental para la preparación de muestras es el siguiente:
-
Equipo de secado por punto crítico de la marca
ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES, modelo EMS 850
-
Metalizador (Au) / Evaporador (C) de la marca BALZERS,
modelo
SCD 004 y otro modelo MED 020, ambos de bajo vacío.
EXPERIENCIA
DEL EQUIPO
Debido
por un lado a la versatilidad de la técnica y a que
está a disposición tanto de los miembros de la
Universidad de Alicante como de empresas y otros organismos, es amplia
la variedad de muestras que han sido analizadas en MEB. Como ejemplos
se pueden destacar: carbones, zeolitas, metales, restos
arqueológicos, minerales y rocas, muestras biológicas de
todo tipo (hojas, polen, hongos, insectos, células, etc.),
materiales de construcción, etc.
PERSONAL
Andrés Amorós
Rodríguez
Verónica
López Belmonte
Teléfono: 96590 3400 Ext. 3353
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