CONCEPTOS BÁSICOS
En
RMN se estudian sistemas de espín nucleares, núcleos con
I ¹ 0. Las fases temporales de cualquier experimento de RMN son
las que se ilustran en el Esquema 1.
Teóricamente
éstos núcleos absorben energía del rango de
frecuencia de las ondas de radio cuando se encuentran expuestos a un
campo magnético intenso y estático (B0) y se emplea como
fuente de excitación una onda electromagnética de
frecuencia determinada,
Una
vez excitado el sistema, éste tenderá a recuperar su
estado de equilibrio termodinámico, 7; la ventaja de la RMN
sobre otras técnicas espectroscópicas radica en que el
tiempo que invierte el sistema en recuperar su estado de equilibrio es
muy grande con lo que hay gran probabilidad de que se produzcan
interacciones entre los espines; interacciones que se
traducirán en información estructural 5 y 6.
Esquema 1
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Normalmente
la señal que se obtiene es de naturaleza sinusoidal y
está amortiguada. La pérdida de señal no indica
que el sistema se haya relajado totalmente, haya recuperado su estado
de equilibrio termodinámico. Los tiempos de relajación en
RMN son muy largos, esto es una ventaja desde el punto de vista de
información estructural que se puede obtener (mayor cuanto
más interacciones se produzcan) pero un inconveniente a la hora
de hacer experimentos con muchas acumulaciones (requerirán mucho
tiempo).
Una
muestra, de la que sea esperable señal de RMN, en el estado de
equilibrio y en presencia de un campo se puede representar por un
vector magnetización macroscópica (Mz), véase
Esquema 2. [ `] indica que la representación es desde el sistema
de referencia del espectrómetro de RMN.
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Esquema 2
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| Los
espectrómetros DRX son equipos de transformada de Fourier (FT);
la espectroscopia de RMN-FT se fundamenta en el concepto básico
de pulso de radiofrecuencia. Normalmente en las condiciones en que se
llevan a cabo los experimentos de RMN, en el sistema de referencia del
espectrómetro, un pulso de RF se representa como se indica en el
Esquema 3. |
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Esquema 3
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Un pulso se caracteriza por su duración Dt, Longitud del Pulso:
pX (X=0,1, 2,...)en el DRX500, unidades: ms. Los pulsos
más comúnmente empleados en RMN son los pulsos
rectangulares, en los que la potencia de la fuente de RF se ha
mantenido constante durante todo el intervalo Dt. Cuando se aplica un
pulso de RF sobre la muestra, Mz nuta (gira) es por ello que suele ser
común referirse a los pulsos en función de la
nutación provocada; así, se puede hablar pulsos de
180º, 90º, 45º, 30º, 15º, etc. (Esquema 4).
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Esquema 4. Efecto de la nutación sobre Mz
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Los
espectrómetros de RMN no trabajan con la máxima potencia
de los pulsos si no que emplean atenuadores. Para describir un pulso
correctamente se debe dar además de su duración, pX, el
nivel de atenuación: plY (Y=0,1,2,...) que se mide en la escala
de decibelios (dB). Es decir, son infinitas las combinaciones de pX y
plY que pueden provocar una nutación de Mz de 90º; sin
embargo una vez fijado, por ejemplo plY, sólo es posible
encontrar un pX que cause la nutación deseada.
Cuando se desee
estimar la longitud de un pulso de 90º, pX2, a una atenuación, plY2,
dada conociendo el valor del pulso de 90º en otras condiciones de
atenuación, esto es, se conoce pX1 y plY1, se puede emplear la
expresión siguiente:
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| También
se puede estimar haciendo uso de la Tabla 3 u otra similar construida
por el interesado, teniendo en cuenta que si se suman 6 dB de
atenuación el nuevo pulso tendrá una duración
doble a la del pulso de partida. |
| Atenuación DB |
1
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6
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10
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12
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18
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| Longitud del pulso/ ms |
1.1
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2.0
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3.2
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4.0
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7.0
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En
RMN el diseño del equipo es tal que sólo es posible medir
la magnetización (o sus componentes) que se encuentran sobre el
plano x`y`(Esquema 2), y no es posible tener señal de la
magnetización alineada según el eje z.
La señal de RMN
Si
se tienen diferentes tipos de espines capaces de dar señal de
RMN en un mismo espectro, en el sistema de referencia del
espectrómetro de RMN se tendría que tras un pulso
de 90º salvo uno (como mucho) el resto de vectores
magnetización se encontrarán girando en torno al eje z`;
además el sistema de espín tiende a relajarse y por tanto
la magnetización que se encuentre en el plano x`y`
tenderá a desaparecer con el tiempo. Si situamos una bobina
receptora, capaz de medir variaciones de flujo magnético en el
eje x`, por ejemplo, esta bobina medirá una señal que es
una función sinusoidal amortiguada con el tiempo que recibe el
nombre de FID (caída libre de la inducción = Free
Induction Decay), véase el Esquema 5.
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| Esquema 5. La FID |
| El procesado de la Señal
La
FID es una representación de la señal como una
función temporal, el procesado de la señal implica
cambiar la escala de tiempo, S(t), a la escala de las secuencias, S(w),
esto se realiza mediante la transformada de Fourier. La
expresión que permite tal transformación viene dada por
la ecuación:
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El
tratamiento de la señal en RMN de FT es puramente
matemático y se hace uso de las propiedades de las
transformada de Fourier para obtener la señal como una
función de la frecuencia. Así, por ejemplo, se puede
multiplicar S(t) por otras funciones con objeto de mejorar la
sensibilidad (exponenciales, parámetro lb) y la
resolución (gaussianas, parámetros lb y gb), este
tratamiento matemático recibe el nombre de
apodización.
Con
objeto de mejorar la resolución (tratamiento “cosmético”)
se puede emplear la técnica de llenado de ceros (zero
filling) que permite distinguir señales que no son
distinguibles empleando la resolución digital de trabajo, esta
operación puede ser muy práctica en experimentos
multidimensionales.
Una herramienta de
procesado muy potente es la predicción lineal, permite truncar
(partir)
la FID y calcular la parte eliminada a partir de los datos disponibles
[Si(t), ti] de la porción de FID conservada. Cada nuevo valor se
representa como una combinación lineal de los anteriores. Esta
técnica mejora considerablemente la relación S/N
(señal/ruido) y es muy útil con experimentos
multidimensionales.
Una vez obtenido el espectro de RMN, S(w), se debe proceder
a:
1.- Ajuste de la fase para obtener señales lorencianas (las
señales de RMN) lo mas simétricas posibles y por tanto
integrables. El ajuste de la fase se realiza a dos niveles
a) orden cero o independiente de la frecuencia y b) primer orden o
dependiente de la frecuencia.
Un ejemplo de fase no ajustada sería el que se
muestra en la figura siguiente:
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| tras ajustar la fase se tiene el siguiente espectro |
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sólo
tras ajustar la fase se puede proceder otras operaciones de procesado
como son la calibración y la integración.
2.- Calibración del espectro: se debe tomar la señal de
disolvente o de la referencia de desplazamiento químico conocido
y asignarle su valor.
Ejemplo: en la figura siguiente se muestra el espectro de 13C-RMN en CDCl3 de una molécula
orgánica. La señal del CDCl3 (un triplete cerca de 80 ppm) se calibrar al valor de 77.15
ppm.
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3.- Integración del espectro: el área que ocupa la
señal lorenciana está relacionada con el número de
núcleos que producen dicha señal. La integración
de las señales del espectro de RMN permite determinar la
relación entre el número de núcleos responsables
de una señal con respecto a otra dada.
DEFINICIÓN Y
APLICACIONES
La
Resonancia Magnética Nuclear de líquidos es una de las
herramientas más potentes con la que cuentan los químicos
para llevar a cabo análisis cualitativos y cuantitativos. Se
emplea para analizar todo tipo de moléculas tanto
orgánicas como inorgánicas. La principal
limitación de la técnica es su escasa sensibilidad,
comparada con otras técnicas espectroscópicas lo que
obliga a requerir cantidades apreciables (1 mg en caso de 1H-RMN) del
analito puro en volúmenes de muestra de aproximadamente 500 ml.
La RMN estudia un
sistema de espines nucleares que en presencia de un campo
magnético
estático es capaz de absorver energía de radiofrecuencia
(RF) cuando se irradia con una fuente de RF.
Elementos:
La
RMN es aplicable, en teoría, a todos los isótopos de los
elementos del sistema periódico que posean espín nuclear
distinto de cero (I ¹0), sin embargo los factores que afectan a la
sensibilidad (S/N) hace que no todos estos isótopos sean
útiles en RMN. En la Tabla 1 se resumen los núcleos
más comúnmente empleados en RMN, se indica además
los espectrómetros del SICAI de la Universidad de Alicante donde
es posible realizar estos experimentos.
Tipo de Muestras:
Por
RMN es posible analizar todo tipo de moléculas, pero dada la
limitación de sensibilidad de la técnica cuanto
más grandes sean las moléculas objeto de estudio tanto
mayor será el campo magnético requerido en la
configuración del espectrómetro. Para obtener un espectro
de calidad y útil desde el punto de vista analítico en
RMN interesará que la muestra haya sido previamente purificada
hasta el punto de que no acompañen otros analitos a la sustancia
objeto de estudio.
- Muestras
analizables en el espectrómetro Bruker DRX 300
- Moléculas
orgánicas de bajo peso molecular
- Moléculas
inorgánicas de bajo peso molecular
- Muestras
analizables en el espectrómetro Bruker DRX 500
-
Moléculas
orgánicas de bajo peso molecular, mejora en resolución y
sensibilidad frente a DRX 300.
-
Moléculas
inorgánicas de bajo peso molecular, mejora en resolución
y sensibilidad frente a DRX 300.
-
Biomoléculas,
proteínas por ejemplo, sin marcar isotópicamente, menores
de 15 kDa de peso molecular; y biomoléculas marcadas
isotópicamente mayores de 15 kDa. La intensidad del campo
magnético (11.7 T en DRX-500 puede ser un factor limitante para
el análisis de proteínas de gran tamaño) siendo
aconsejable el uso de campos mayores para la elucidación
estructural con estas muestras.
REQUISITOS DE LAS MUESTRAS
RMN de Líquidos
Las
muestras deberán disolverse en un volumen aproximado de 0.6 ml
de disolvente deuterado (aproximadamente 4 cm en el tubo de
RMN).
Los tubos deben estar en condiciones óptimas de uso:
-
Sin riesgo en su
manipulación (bordes cortantes, tapones que no ajusten, pared
exterior del tubo sucia, etc)
- Longitud
mínima: 16 cm
Las
disoluciones deben ser claras, sin residuos sólidos, con una
concentración homogénea. Todas las disoluciones se deben
filtrar antes de introducirlas en el tubo.
Se
deberá indicar, en la etiqueta del tubo y en el formulario, si
la muestra contiene algún agente especialmente
tóxico que involucre riesgo para la salud y/o durante la
manipulación (agentes cancerígenos, compuestos de metales
de transición, etc).
Las
muestras que no cumplan las estas condiciones serán devueltas a
los usuarios para que las preparen de manera adecuada.
INSTRUMENTAL
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Espectrómetro de RMN de 300 MHz (BRUKER AC300)
provisto de:
- Sonda dual 1H/13C
(5 mm),
- Unidad de
temperatura variable
- Intercambiador
automático de muestras con capacidad para 60 muestras (BAC-S 60).
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Espectrómetro
de RMN de 500 MHz (BRUKER AVANCE DRX500) provisto de:
- Sonda multinuclear
directa de banda ancha (BBO) de 5 mm.
- Sonda multinuclear
inversa de banda ancha (BBI) de 5 mm con gradiente de campo,
- Unidad de
temperatura variable.
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| MANEJO DE LOS EQUIPOS
El servicio tiene dos formas de funcionamiento:
-
A
través del personal técnico de los SS.TT.I. en horario de
8:00 a 15:00 y de 16:00 a 18:30, excepto desde el 1 de julio hasta el
15 de septiembre que es de 8:30 a 14:30.
-
Usuarios
autorizados, que harán uso del equipo fuera del horario del
personal técnico o en casos especiales.
Estos
usuarios, tras la superación de un curso de manejo del equipo,
serán autorizados por la Dirección de los SS.TT.I. previa
aprobación por el Comité Científico de RMN.
Aquellos
usos indebidos o no autorizados que puedan causar daño o
perjuicio sobre los equipos de la Unidad de Resonancia Magnética
deberán ser subsanados con cargo al departamento o grupo
correspondiente.
Reservas de turnos
Como
norma general el servicio se distrubuirá en turnos:
mañana, mediodía, tarde, noche y fin de semana. Si no ha
sido reservado previamente alguno de ellos, véase calendario,
los técnicos de la Unidad de Resonancia Magnética
atenderán las muestras como se detalla en el párrafo
siguiente.
Los
experimentos, en general, se realizarán por riguroso orden de
recepción aunque el personal técnico tendrá
potestad para modificar dicho orden si ello redunda en una
optimización del tiempo y del buen funcionamiento del equipo.
Así mismo, también se podrá modificar este orden
atendiendo a principios de uso equitativo de los equipos por parte de
todos sus usuarios.
Cuando
se desee realizar experimentos especiales (aquellos que se salgan de lo
que formalmente se entiende como rutina) o de duración
prolongada (fin de semana, noche) será necesaria la reserva de
la Unidad.
La reserva del
servicio debe solicitarse al personal técnico de la Unidad
de Resonancia Magnética.
Es
condición indispensable para realizar la reserva rellenar el formulario
electrónico.
En él se detallan datos sobre la muestra y los experimentos a
realizar, datos de la persona que autoriza el gasto, etc. Se
rellenará un formulario por cada intervalo de tiempo en el
que se quiera usar los equipos.
Todo
aquel estudio que por sus características técnicas,
analíticas, etc. presente alguna dificultad deberá ser
concertado previamente con el servicio.
El
tiempo reservado computa como tiempo de uso del equipo en el turno que
corresponda y será considerado como tal a efectos de cobro
aplicándosele la tarifa correspondiente a dicho turno.
PERSONAL
Dr. Emilio Lorenzo
Martínez
Tfno.:
965.90.98.76
Fax:
965.90.36.43
Vicente Ráez Tobarra
Tfno.: 965.90.98.76
Fax:
965.90.36.43
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